Szybkie Testy Toksyczności

Szybkie testy toksyczności, często nazywane testami toksyczności ostrej, mają zastosowanie do badań ciężkich przypadków wywołanych ekspozycją o stosunkowo krótkim czasie trwania. Jeśli uzyskuje się tak jakikolwiek efekt w postaci reakcji na stresor tożsamy z mierzalnym kryterium, szybki test toksyczności polega na określeniu liczby osobników, u których stwierdzono reakcję na dany związek chemiczny lub inne zaburzenie w środowisku. Podobnie jak w toksykologii człowieka, zastosowanie ma tu LD₅₀ jako empiryczne oszacowanie dawki wywołującej śmierć 50% osobników w badanej populacji. Tak jak LD₅₀ definiowane jest LC₅₀ w celu określenia wartości stężeń w powietrzu lub w wodzie, które powodują śmierć 50% populacji. Szybkie testy toksyczności używane są też do określenia dawki wywołującej reakcje inne niż śmiertelne, nazywanej EC₅₀, która definiowana jest jako stężenie czynnika wywołujące określony efekt u połowy populacji. Na rysunku przedstawiono wyidealizowany obraz reakcji organizmu na dawkę, mierzonej w postaci określonych zmian fizjologicznych, włącznie ze śmiercią policzalnej liczby osobników w populacji.

Test ostrej toksyczności może być prowadzony na wiele sposobów. Niektóre organizmy (np. bezkręgowce) trudno jest uśmiercić. Z tego powodu publikowane są wartości EC₅₀ po 96 godzinach ekspozycji, którym odpowiada efekt końcowy polegający na unieruchomieniu lub utracie równowagi zamiast śmiertelności.

Techniki utrzymywania organizmu testowego w warunkach ekspozycji mogą w przypadku testu ostrej toksyczności przyjmować formę : statyczna, recyrkulacja, odnawiana i przepływowa. Metody te różnią się pod względem zasady wprowadzania i utrzymywania stresorów do środowiska życia populacji badanej. W celu zbadania wpływu na zjawisko toksyczności również mogą być manipulowane inne parametry jakości środowiska wodnego (np. rozpuszczony tlen, twardość).

Można projektować testy ostrej toksyczności w sposób dogodny dla wyjaśnienia konkretnych kwestii związanych z gospodarką odpadami. Badaniu można poddać toksyczność związku chemicznego, mieszaniny chemikaliów, wycieku albo innych stężonych strumieni odpadów. Testy również można użyć do zlokalizowania "gorących punktów" na skażonym terenie, jak też do analizy efektywności technologii neutralizacji odpadów. Żeby osiągnąć wartościowe wyniki należy prawidłowo wybrać organizm testowy, układ symulujący ekspozycję i warunki brzegowe. Opracowanie wyników testów toksyczności wymaga kombinacji znajomości procedur statystycznych i doświadczenia w interpretacji wyników takich procedur.

Interpolacja graficzna wartości LC₅₀ zależnej od czasu ekspozycji.

Długotrwałe testy toksyczności, znane pod nazwą testy toksyczności chronicznej, służą do zbadania niekorzystnych oddziaływań czynnika trującego na osobniki, gatunki i populacje. Prowadzone są w warunkach laboratoryjnej przedłużonej ekspozycji osobników na różnych stadiach rozwoju (np. embrion, młodzież, dojrzały płciowo). Takie testy pozwalają na określenie wpływu na rozwój, homeostazę, wzrost i potencjał reprodukcyjny, co umożliwia wyznaczenie stężenia granicznego dla trucizny, przy którym ujawniają się efekty długoterminowe. Takimi granicznymi stężeniami są najniższe wartości stężenia, dla których już pojawiają się niekorzystne oddziaływania, co określa nazwa najniższy poziom dla widocznego efektu LOEL . Podobnie określa się najwyższy poziom bez ujawnienia efektu NOEL, który wyznacza najwyższe stężenie, przy którym jeszcze nie ujawniają się niekorzystne efekty działania trucizny.

Ponieważ stężenia chemikaliów powodujące efekty chroniczne zwykle są niższe niż wywołujące efekty ostre, wielkość określająca toksyczność chroniczną jest bardziej czułym miernikiem toksyczności. Dla określenia akceptowalnych wartości stężeń ekspozycji (np. standardów jakości wody), ekotoksykolodzy stosują podkategorię testów toksyczności chronicznej, nazywaną testami cyklu życia. Te specjalne testy polegają na obserwacji reakcji reprezentantów poszczególnych gatunków w całym czasie ich życia. Służą do oceny wpływu na przeżywalność, wzrost i reprodukcję. Na przykład test cyklu życia dla ryb słodkowodnych będzie obejmował ekspozycję embrionów, młodzieży na kolejnych etapach dojrzewania, dojrzałych płciowo - aż do reprodukcji i pojawienia się kolejnej generacji. Stary dogmat toksykologii organizmów wodnych mówi, że wczesne stadia rozwoju są najbardziej wrażliwe na toksyny. Opracowane informacje z 56 pełnych lub częściowych testów cyklu życia dowodzą, że fazy życia embrionalno-larwalnego i wczesnej młodzieży są najwrażliwszymi w większości przypadków.

Problem związany z testami toksyczności chronicznej to czas, więc koszt ich wykonania. Wprawdzie testy cyklu życia mają wielkie znaczenie dla podejmowania decyzji, jednak tego rodzaju badania są ograniczone z kilku powodów:
1) nie wszystkie gatunki rozmnażają się w warunkach laboratoryjnych,
2) nie są niezbędne albo są bardzo kosztowne,
3) trucizna jest wprowadzana do środowiska w stałym stężeniu niezbędnym dla stabilności zagrożenia, podczas gdy w naturze wielkość, częstość i trwałość warunków ekspozycji może zmieniać się znacznie, a w końcu
4) można zbadać tylko niewielką część spośród toksycznych chemikaliów uwalnianych do środowiska wodnego.

Biomarkery

Zastosowanie biomarkerów do identyfikacji zagrożenia lub efektów fizjologicznych różni się od tradycyjnych metod badań ekologicznych (np. pomiarów chemicznych, testów toksyczności) dzięki użyciu organizmów występujących w naturze jako wskaźników dla reakcji ekosystemu. Podłożem koncepcji biomarkerów jest obserwacja, że wybrane kryteria mierzalne, zwykle związane z reakcjami biochemicznymi lub fizjologicznymi, mogą służyć za czułe wskaźniki ekspozycji lub efektów innych niż śmierć (stres nie-śmiertelny).

W sytuacji kiedy wielka złożoność utrudnia pomiary skażeń i ocenę zagrożenia ze strony ekotoksyn w szybko zmieniającym się środowisku naturalnym, narasta potrzeba opracowania ocen zagrożenia ze strony chemikaliów przy użyciu biomarkerów. Ten rodzaj mierników, korzystających z obserwacji płynów fizjologicznych, komórek i tkanek, umożliwia ocenę na poziomie komórkowym i subkomórkowym wielkości zagrożenia chemicznego oraz rodzaju reakcji organizmu. Równocześnie prowadzone są intensywne badania nad udoskonaleniem istniejących metod i opracowaniem nowych wskaźników ekspozycji i reakcji. Z doświadczenia wynika, że zastosowanie biomarkerów usprawnia proces decyzyjny w gospodarce niebezpiecznymi odpadami.

Miernikiem ekspozycji na chemikalia jest ich bioakumulacja w tkankach, co łatwo wykryć przy pomocy analizy śladowej. Kiedy wyniki takie nie są dostępne, ekotoksykolodzy opracowali wiele stałych empirycznych ułatwiających oszacowanie bioakumulacji. Współczynnik podziału oktanol-woda (K _ow ) pozwala przybliżyć sposób zachowania się chemikaliów na granicy faz lipidu i wody. Współczynnik biokoncentracji (BCF) opisuje zależność stężenia chemikaliów w organizmie w relacji do jego stężenia w otaczającym środowisku (zazwyczaj w wodzie). BCF definiuje równanie empiryczne:

Wynik rutynowego monitoringu osadów i wód powierzchniowych poniżej składowiska odpadów niebezpiecznych dostarczył informacji o przekroczeniu dopuszczalnych stężeń pestycydu DDT. Średnie wyniki zawartości DDT wynoszą dla osadów 33mg/kg i dla wody powierzchniowej 0.25mg/L. Ponieważ U.S. Food and Drug Administration wymaga po przekroczeniu przez stężenie DDT w rybach poziomu 5ppm podjęcia akcji dekontaminacji warstwy wodonośnej, czy należy spodziewać się przekroczenia wskutek bioakumulacji DDT w tkankach ryb żyjących w pobliżu składowiska?

Rozwiązanie. Ponieważ rutynowy monitoring nie dostarcza informacji o śladowych ilościach DDT w tkankach ryb, należy tą wartość oszacować przy wykorzystaniu wartości współczynnika bioakumulacji BCF z tablicy 5-14. Z danej Log BCF = 4.78 wyliczamy, że wartość BCF wynosi 60,256 (mg/kg DDT w tkankach przy zawartości 1mg/L wody, lub L/kg). Po podstawieniu danych z monitoringu i wartości BCF dla DDT do równania otrzymamy:

,co prowadzi do obliczenia zawartości DDT w tkankach w przybliżeniu równej 15 mg/kg . Z tego oszacowania wynika, że należy zbadać rzeczywistą zawartość DDT w tkankach, gdyż może to być problemem.

Biomarkerem umożliwiającym uzyskanie informacji o stresie mniejszym niż śmiertelny, jak też o zaistnieniu zagrożenia, jest enzym dehydrataza kwasu d-aminolewulinowego (d-ALA-D). Enzym ten katalizuje reakcję związaną z syntezą hemu, więc jest niezwykle wrażliwy na inhibicję wskutek obecności ołowiu nieorganicznego. d-ALA-D pozwala niedrogo ocenić skażenie ołowiem, co ułatwia wyjaśnienie wątpliwości zdarzające się często w badaniach próbek ekologicznych. Na terenie składowania odpadów, gdzie skażenie ołowiem stanowi poważny problem, d-ALA-D jako miernik występowania ekspozycji na niższym niż śmiertelny poziomie umożliwia obserwację reakcji organizmów na takie skażenia, chociaż w takich miejscach obecność wielu metali śladowych może bardzo ograniczyć użyteczność tej metody.

Innym często stosowanym biomarkerem ekspozycji na metale śladowe jest wiążąca metale proteina metalotionen. Funkcją metalotionenu jest regulacja metabolizmu cynku i miedzi, jak również bierze udział w detoksyfikacji tkanek z metali. Zmiana aktywności metalotionenu jest czułym wskaźnikiem ekspozycji na metale śladowe.

Wśród innych biomarkerów ekspozycji ekologicznej na skażenia związkami organicznymi trzeba wymienić indukcję enzymów metabolicznych (detoksyfikujących), takich jak oksydazy wielofunkcyjnej (MFO) lub cytochromu P450. Również inhibicja cholinesterazy w mózgu przez substancje insektobójcze z grupy organofosforanów, jak też reakcje niespecyficzne w rodzaju deformacji kośćca.